罕見病，又稱為“孤兒病”，一般為慢性的嚴重性疾病，常危及生命。罕見病種類已達8000多種，只有不到1%的疾病具有可行的治療方案，其中80%以上的罕見病是由遺傳因素導致的，50%以上的罕見病會在出生時和兒童期發病並導致死亡📭。中國約2000萬的罕見病患者，且每年新增患者超過20萬。而廣泛分布的罕見病，如苯丙酮尿症、β地中海貧血、杜氏肌營養不良症等，多為單基因遺傳病，即由單個基因突變導致的遺傳性疾病。

杜氏肌營養不良症(Duchenne muscular dystrophy)，簡稱DMD，是一種X染色體隱性遺傳病，由編碼肌營養不良蛋白的基因突變引起，主要在男孩中發病，突變中約有10%是無義突變類型，即編碼氨基酸的密碼子突變為提前終止密碼子（premature termination codon, PTC），屬於PTC疾病。據統計，全球平均每3500個新生男嬰中就有一人罹患此病，我國的發病率高於此比例。患者一般在3-5歲開始發病，最早表現出進行性腿部肌無力，導致不便行走。12歲時失去行走能力，20歲-30歲因呼吸衰竭而死亡。目前該病尚無有效的治療方法👩🏻‍🏭。

基因密碼子擴展技術利用終止密碼子編碼人工合成氨基酸（unnatural amino acid, UAA）的前沿生物技術，可精準的用於PTC位點引入UAA，而不影響蛋白正常終止密碼子的翻譯功能。此項技術主要使用aaRS（aminoacyl-tRNA synthetase）/tRNA正交系統在發生無義突變的位點通讀突變密碼子，達到翻譯全長蛋白的治療目的。

意昂2平台藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室夏青教授在生命科學相關領域有著多重交叉學術背景，所涉及方向有臨床醫學、免疫學、神經科學⚜️、無機化學及生物化學，具有敏銳且新穎的科學研究視角，立足前沿生物技術領域，面向醫學和生命科學重要問題⛹🏿‍♀️。

2021年8月2日，夏青團隊在Nature Biomedical Engineering 在線發表了文章“Restoration of dystrophin expression in mice by suppressing a nonsense mutation through the incorporation of unnatural amino acids”，該研究首次實現了利用基因密碼子擴展技術恢復內源性Dystrophin蛋白的全長表達，在肌肉幹細胞和PylRS/mdx小鼠疾病模型上系統評價了該方法用於治療DMD的安全性🥘、有效性和可行性，並完成了不同方式遞送AAV-PylRS-tRNAPyl的安全性和治療效果評價，為DMD和無義突變罕見病治療提供了新策略。此項研究已於2016年申報中國和美國專利，目前正積極投入臨床前實驗研究中。

在該課題中，研究者選擇了吡咯賴氨酸系統PylRS-tRNAPyl，該系統可以將非天然氨基酸NAEK定點插入到蛋白質。研究者首先拓展了可以通讀3種提前終止密碼子（TAG🆓、TGA與TAA）的PylRS-tRNAPyl系統，在HEK293T細胞中 驗證非天然氨基酸NAEK依賴性和正交性。然後，研究者構建了含不同PTC位點的dystrophin模型蛋白Dp71b，將其質粒與PylRS-tRNAPyl系統質粒共同轉染給HEK293T細胞，證明3種正交系統均可通讀模型蛋白Dp71b💇‍♀️🍚。進一步，研究者在從疾病模型mdx小鼠和DMD病人分離得到的肌肉分化幹細胞上進行驗證，均檢測到dystrophin蛋白的表達恢復，初步驗證PylRS-tRNAPyl系統可以在細胞水平恢復內源Dystrophin蛋白的全長表達🦾。

在動物層面上，研究者首先嘗試將PylRS-tRNAPyl質粒直接電穿孔轉染到小鼠的脛前肌中，dystrophin可恢復少量表達，初步表明了該方法可以在mdx小鼠上恢復內源蛋白表達。為進一步評價該方法用於DMD疾病不同組織的長期治療效果，解決電轉對小鼠組織的損傷和質粒降解問題，研究者創新性的建立了含有編碼新型氨基酸的PylRS-tRNAPyl正交轉基因小鼠，將其和發病mdx小鼠交配獲得PylRS/mdx轉基因疾病小鼠模型，此模型可以穩定表達PylRS/tRNAPyl系統並呈現mdx小鼠類似的dystrophin缺陷，因此適合長期治觀察療效。對小鼠進行8周的腹腔註射NAEK，在第1, 2, 4, 6, 8周分別對小鼠進行握力測試，肌肉組織dystrophin蛋白表達量檢測，血液生化檢測，組織病理染色分析及安全性評價。結果發現實驗組小鼠在註射NAEK第4周後蛋白恢復量達到平臺期（30%左右），與對照組小鼠相比，第4, 6, 8周實驗組小鼠的握力明顯增加，CK激酶含量下降，肌肉組織的正常肌細胞的比例明顯上升，表明該方法可恢復小鼠dystrophin蛋白全長表達及其部分生理功能，治療效果顯著，遠優於小分子通讀藥物治療。

最後，為評價該方法推向臨床治療應用的可行性/可轉化性，研究者用AAV作為載體構建了AAV-PylRS-tRNAPyl系統，以腹腔註射和肌肉註射兩種方式，分別評價其在mdx小鼠上的全身/局部治療效果，兩種方式註射AAV-PylRS-tRNAPyl均有明顯治療效果，均呈現出NAEK依賴性，可以通過停用或調整非天然氨基酸的用量來控製基因治療的效果，有望實現精準的可控治療。

綜上，該項研究使化學家建立的體外蛋白質定點標記技術突破性的走進醫學的世界，實現了在體內任意氨基酸的精準替換，拓展了人工合成氨基酸在生物醫學中的廣闊應用前景。並且首次實現人工氨基酸正交翻譯體系在無義突變疾病中的實驗性治療，這是繼小分子通讀藥物、單堿基基因編輯之後的第三種通用治療罕見病的方法，有望引領新一代生物治療的醫學前沿陣地💂🏼。

意昂2平台藥學院夏青團隊研究生史寧寧、楊琦，博士後張浩然為該論文的共同第一作者，夏青教授為通訊作者。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41551-021-00774-1

（天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室）

編輯：玉潔